Detección de glucosa con un biosensor de fabricación propia 3/5 - Inmovilización de biosensores enzimáticos
Este capítulo forma parte de la serie "Detección de glucosa con un biosensor de fabricación propia basado en glucosa oxidasa". En esta sección se explica el funcionamiento de los biosensores.
Inmovilización de biosensores enzimáticos
Los biosensores basados en enzimas se dividen en sistemas de transferencia directa e indirecta de electrones. Una transferencia directa de electrones significa que los electrones se transfieren directamente desde o hacia el centro activo de la enzima al electrodo. Una transferencia indirecta de electrones utiliza un mediador redox o el producto de la reacción enzimática para transportar electrones entre el centro activo de la enzima y el electrodo. La transferencia directa de electrones es más eficaz una vez que se ha establecido, pero inmovilizar una enzima para la transferencia directa de electrones es bastante difícil. El centro activo se encuentra dentro de una envoltura proteica aislante. A partir de cierta distancia, la transferencia de electrones se hace imposible. Estas condiciones se describen en la teoría de Marcus [1]. La posibilidad de una transferencia directa de electrones depende de la estructura de la enzima, es decir, si la enzima tiene una cubierta proteica gruesa alrededor del centro activo, la transferencia directa de electrones no es posible.
Adsorción
Es difícil decir si el gran número de métodos de inmovilización presentes hoy en día se ha desarrollado a pesar o a causa de estos retos. Un método sencillo para inmovilizar elementos biológicos de reconocimiento es la adsorción simple (véase la figura 2.1).
Algunos materiales de electrodos interactúan con las proteínas con la suficiente fuerza como para no ser lavados. Por ejemplo, muchas especies de carbono muestran interacción π-π así como van-der-Waal y, a menudo, una mezcla de grupos funcionales. Las superficies de oro se unen a aminoácidos que contienen azufre, como la cisteína. Aunque esta técnica es muy fácil de realizar y, por tanto, popular sobre todo en los primeros pasos de la investigación, las proteínas adsorbidas son sensibles a los cambios de fuerza iónica, es decir, al número de iones en solución, al pH, así como a la temperatura, por lo que pueden desorberse de la superficie si cambia una condición. Es muy probable que el contacto directo con la superficie de un electrodo provoque la desnaturalización de la proteína adsorbida. Es posible modificar el electrodo cubriéndolo con una monocapa que cree un entorno adecuado para la enzima, que no cause desnaturalización y que permita la transferencia de electrones (mediada o directa). Un ejemplo de este tipo de modificación superficial es una monocapa autoensamblada de piridina tiol sobre un electrodo de oro. Si el citocromo c se adsorbe a esa superficie, la transferencia de electrones entre el citocromo c y el electrodo mejora en comparación con un electrodo vacío.
Unión covalente
Otra técnica es la unión covalente de las proteínas al electrodo. Las monocapas autoensambladas, por ejemplo, pueden proporcionar los grupos funcionales necesarios para crear una unión covalente (véase la figura 2.2). Una capa de ácido 3-sulfanilpropanoico sobre una superficie de oro se unirá a ésta con el grupo azufrado y formará una monocapa autoensamblada. Los grupos carboxílicos pueden activarse y formarán un éster unido a los grupos amina de los elementos de reconocimiento biológico y, de este modo, unirán el elemento de reconocimiento biológico a la superficie.
Un enlace covalente es estable y la inmovilización ya no es sensible a las condiciones de la solución que rodea al electrodo. Si se conoce la posición del grupo funcional en el elemento de reconocimiento que se utiliza para el enlace covalente, también se conoce y define la arquitectura de la superficie tras la inmovilización. La activación de la superficie del electrodo para crear un grupo funcional adecuado para el enlace covalente suele ser la parte difícil.
La adsorción y la unión covalente son adecuadas para los biosensores de transferencia de electrones mediada y directa. Una transferencia mediada necesita que los productos de la reacción enzimática sean el mediador o un mediador redox coinmovilizado en la superficie del electrodo. Si no hay ningún mediador inmovilizado, es necesario añadir a la solución de la muestra un mediador redox de difusión libre.
Atrapamiento en una matriz polimérica
Un enfoque muy diferente es el atrapamiento de una enzima en una matriz polimérica. La idea es crear una capa de polímero en la superficie del electrodo que tenga enzimas capturadas en su interior como una red de pesca. La enzima sólo puede funcionar si el polímero no interfiere en la reacción enzimática. Si el polímero deforma la enzima, bloquea la difusión del analito a la enzima, la difusión de los productos de la enzima lejos de la enzima o el movimiento del mediador entre la enzima y el electrodo, el biosensor no funcionará. Dado que los polímeros se producen con una enorme variedad de estructuras y propiedades, hoy en día se conocen muchos biosensores basados en polímeros.
El polímero y la matriz enzimática pueden aplicarse al electrodo de diferentes maneras. Un método muy sencillo es el recubrimiento por goteo. El polímero y la enzima se disuelven en un disolvente orgánico. Se coloca una gota de esta solución sobre el electrodo de trabajo y se seca (véase la Figura 2.3a). Otra forma es utilizar un polímero que sólo sea soluble en una solución acuosa en un determinado intervalo de pH.
Tras mezclar el polímero y la solución enzimática, se sumerge el electrodo en la solución de polímero y, a continuación, en una solución fuera del intervalo de pH del polímero. Esto se repite varias veces. Otra opción es sumergir el electrodo en la solución de polímero y modificar el pH sólo localmente aplicando un alto potencial catódico o anódico (véase la figura 2.3b). El polímero precipitará en las proximidades del electrodo.
Electropolimerización
Otro método consiste en crear enlaces para formar el polímero en presencia de la enzima. Las moléculas que formarán el polímero se denominan monómeros. Hay diferentes formas de realizar la polimerización. Una forma común es añadir una solución de reticulantes, en la que los monómeros ya han formado cadenas cortas (oligómeros) que aún son solubles o al menos forman una suspensión. Los reticulantes forman enlaces entre los oligómeros y éstos precipitan en forma de polímero. Otra forma elegante es realizar una electropolimerización. El monómero se activa aplicando un potencial al electrodo. La activación suele consistir en la formación de un radical que ataca a otro monómero dando lugar a un radical dímero. El proceso se repite hasta que el polímero es demasiado largo para permanecer en solución y precipita (véase la figura 2.4).
Un ejemplo común de esta técnica es la formación de polipirrol. La ventaja del pirrol es que el monómero es más difícil de oxidar que sus dímeros, trímeros, etc., por lo que es más probable un crecimiento de la longitud de la cadena que el inicio de una nueva cadena [2]. Si se utiliza una reacción radical, como en el caso del polipirrol, la polimerización puede mejorarse eliminando el oxígeno de la solución de monómero, ya que el oxígeno es un secuestrador de radicales, debido a su naturaleza de diradical.
Además, el polipirrol tiene la ventaja de ser un polímero conductor. El crecimiento no está limitado y puede controlarse mediante el potencial o la corriente aplicados y el tiempo de aplicación. Los electrones también pueden transferirse fácilmente al electrodo. Mientras que los polímeros no conductores necesitan un mediador o un producto electroquímicamente activo de la reacción enzimática para viajar hasta el electrodo (véase la Figura 5a), un polímero conductor puede convertir el mediador o el producto cerca de la enzima y transportar los electrones. En un caso ideal, el polímero es capaz de recoger los electrones directamente del centro activo de la enzima. En este caso, tampoco es necesario añadir el mediador redox a la solución. Los polímeros modificados con complejos metálicos, por ejemplo osmio, han demostrado ser capaces de hacerlo. El polímero contiene un complejo de osmio, cuya envoltura permite al complejo difundirse en el centro activo de la enzima y aceptar o donar electrones. Los electrones saltarán de complejo en complejo hasta llegar al electrodo (véase la Figura 2.5 b). Por supuesto, la distancia entre los complejos y su flexibilidad se eligen de forma que sea posible la transferencia de electrones entre los complejos.
Literatura
[1] Borgmann, S.; Hartwich, G.; Schulte, S.; Schuhmann, W.; «Sensores enzimáticos amperométricos basados en la transferencia directa y mediada de electrones», Perspectives in Bioanalysis, 2005 (1), p. 599.
[2] Schuhmann, W.; «Electrodos enzimáticos amperométricos basados en polímeros conductores»; Mikrochim. Acta, 1995 (121); p. 1