Détection du glucose avec un biocapteur auto-fabriqué 3/5 - Immobilisation de biocapteurs enzymatiques
Ce chapitre fait partie de la série "Détection du glucose à l'aide d'un biocapteur autodidacte basé sur la glucose oxydase". Dans cette section, nous expliquons le fonctionnement des biocapteurs.
Immobilisation de biocapteurs enzymatiques
Les biocapteurs basés sur des enzymes sont divisés en systèmes à transfert d'électrons direct et indirect. Un transfert d'électrons direct signifie que les électrons sont directement transférés du ou vers le centre actif de l'enzyme à l'électrode. Un transfert d'électrons indirect utilise un médiateur redox ou le produit de la réaction enzymatique pour transporter les électrons entre le centre actif de l'enzyme et l'électrode. Le transfert direct d'électrons est plus efficace une fois qu'il a été établi, mais l'immobilisation d'une enzyme pour le transfert direct d'électrons est assez difficile. Le centre actif se trouve à l'intérieur d'une enveloppe protéique isolante. Au-delà d'une certaine distance, le transfert d'électrons devient impossible. Ces conditions sont décrites par la théorie de Marcus [1]. La possibilité d'un transfert direct d'électrons dépend de la structure de l'enzyme, c'est-à-dire que si l'enzyme possède une enveloppe protéique épaisse autour du centre actif, le transfert direct d'électrons n'est pas possible.
Adsorption
Il est difficile de dire si le grand nombre de méthodes d'immobilisation existant aujourd'hui a été développé malgré ou à cause de ces défis. Une méthode simple pour immobiliser des éléments de reconnaissance biologique est l'adsorption simple (voir figure 2.1).
Certains matériaux d'électrode interagissent avec les protéines suffisamment fortement pour ne pas être éliminés par lavage. Par exemple, de nombreuses espèces de carbone présentent une interaction π-π ainsi qu'une interaction van-der-Waal et souvent un mélange de groupes fonctionnels. Les surfaces d'or fixent les acides aminés contenant du soufre, comme la cystéine. Bien que cette technique soit très facile à mettre en œuvre et donc populaire, surtout dans les premières étapes de la recherche, les protéines adsorbées sont sensibles aux changements de force ionique, c'est-à-dire au nombre d'ions dans la solution, au pH, ainsi qu'à la température, et peuvent donc se désorber de la surface si l'une de ces conditions change. Le contact direct avec la surface d'une électrode risque fort de provoquer la dénaturation de la protéine adsorbée. Il est possible de modifier l'électrode en la recouvrant d'une monocouche qui crée un environnement approprié pour l'enzyme, qui ne provoque pas de dénaturation et qui permet le transfert d'électrons (par médiation ou directement). Un exemple d'une telle modification de surface est une monocouche auto-assemblée de pyridine thiol sur une électrode d'or. Si le cytochrome c est adsorbé sur cette surface, le transfert d'électrons entre le cytochrome c et l'électrode est amélioré par rapport à une électrode vierge.
Liaison covalente
Une autre technique consiste à lier de manière covalente les protéines à l'électrode. Les monocouches auto-assemblées, par exemple, peuvent fournir les groupes fonctionnels nécessaires pour créer une liaison covalente (voir figure 2.2). Une couche d'acide 3-sulfanylpropanoïque sur une surface d'or se liera à la surface d'or avec le groupe soufre et formera une monocouche auto-assemblée. Les groupes carboxyliques peuvent être activés et formeront un ester lié aux groupes amine des éléments de reconnaissance biologique et lieront ainsi l'élément de reconnaissance biologique à la surface.
Une liaison covalente est stable et l'immobilisation n'est plus sensible aux conditions de la solution entourant l'électrode. Si la position du groupe fonctionnel sur l'élément de reconnaissance utilisé pour la liaison covalente est connue, l'architecture de la surface après l'immobilisation est également connue et définie. L'activation de la surface de l'électrode pour créer un groupe fonctionnel approprié pour la liaison covalente est souvent la partie la plus difficile.
L'adsorption et la liaison covalente conviennent aux biocapteurs à transfert d'électrons médié et direct. Un transfert médié nécessite soit les produits de la réaction enzymatique comme médiateur, soit un médiateur redox co-immobilisé à la surface de l'électrode. Si aucun médiateur n'est immobilisé, un médiateur redox à diffusion libre doit être ajouté à la solution de l'échantillon.
Piégeage dans une matrice polymère
Une approche très différente consiste à piéger une enzyme dans une matrice polymère. L'idée est de créer une couche de polymère à la surface de l'électrode, dans laquelle les enzymes sont capturées comme dans un filet de pêche. L'enzyme ne peut fonctionner que si le polymère n'interfère pas avec la réaction enzymatique. Si le polymère déforme l'enzyme, bloque la diffusion de l'analyte vers l'enzyme, la diffusion des produits de l'enzyme loin de l'enzyme ou le mouvement du médiateur entre l'enzyme et l'électrode, le biocapteur ne fonctionnera pas. Comme les polymères sont produits avec une grande variété de structures et de propriétés, de nombreux biocapteurs à base de polymères sont connus aujourd'hui.
La matrice de polymère et d'enzyme peut être appliquée à l'électrode de différentes manières. Une approche très simple est l'enrobage par goutte d'eau. Le polymère et l'enzyme sont dissous dans un solvant organique. Une goutte de cette solution est placée sur l'électrode de travail et séchée (voir figure 2.3a). Une autre méthode consiste à utiliser un polymère qui n'est soluble dans une solution aqueuse que dans une certaine plage de pH.
Après avoir mélangé le polymère et la solution enzymatique, l'électrode est plongée dans la solution de polymère, puis dans une solution dont le pH ne correspond pas à celui du polymère. Cette opération est répétée un certain nombre de fois. Une autre option consiste à immerger l'électrode dans la solution de polymère et à ne modifier le pH que localement en appliquant un potentiel cathodique ou anodique élevé (voir figure 2.3b). Le polymère précipite à proximité de l'électrode.
Électropolymérisation
Une autre approche consiste à créer des liaisons pour former le polymère en présence de l'enzyme. Les molécules qui formeront le polymère sont appelées monomères. Il existe différentes manières d'effectuer la polymérisation. Une méthode courante consiste à ajouter une solution de réticulation, dans laquelle les monomères ont déjà formé de courtes chaînes (oligomères) qui sont encore solubles ou forment au moins une suspension. Les réticulants forment des liaisons entre les oligomères et ils précipitent sous forme de polymère. Une autre méthode élégante consiste à effectuer une électropolymérisation. Le monomère est activé par l'application d'un potentiel à l'électrode. L'activation consiste généralement en la formation d'un radical qui attaque un autre monomère, ce qui donne un radical dimère. Le processus est répété jusqu'à ce que le polymère soit trop long pour rester en solution et qu'il précipite (voir figure 2.4).
Un exemple courant de cette technique est la formation de polypyrrole. L'avantage du pyrrole est que le monomère est plus difficile à oxyder que ses dimères, trimères, etc., de sorte qu'une augmentation de la longueur de la chaîne est plus probable que le début d'une nouvelle chaîne [2]. Si une réaction radicale est utilisée, comme dans le cas du polypyrrole, la polymérisation peut être améliorée en éliminant l'oxygène de la solution de monomère, car l'oxygène est un piégeur de radicaux, en raison de sa nature de diradical.
En outre, le polypyrrole présente l'avantage d'être un polymère conducteur. La croissance n'est pas limitée et peut être contrôlée par le potentiel ou le courant appliqué et le temps d'application. Les électrons peuvent également être facilement transférés à l'électrode. Alors que les polymères non conducteurs ont besoin d'un médiateur ou d'un produit électrochimiquement actif de la réaction enzymatique pour se rendre à l'électrode (voir figure 5a), un polymère conducteur peut convertir le médiateur ou le produit à proximité de l'enzyme et transporter les électrons. Dans le cas idéal, le polymère est capable de collecter les électrons directement à partir du centre actif de l'enzyme. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire d'ajouter le médiateur d'oxydoréduction à la solution. Les polymères modifiés avec des complexes métalliques, par exemple l'osmium, se sont révélés capables de le faire. Le polymère contient un complexe d'osmium, dont l'enveloppe permet au complexe de se diffuser dans le centre actif de l'enzyme et d'accepter ou de donner des électrons. Les électrons sautent d'un complexe à l'autre jusqu'à ce qu'ils atteignent l'électrode (voir figure 2.5 b). Bien entendu, la distance entre les complexes et leur flexibilité est choisie de telle sorte qu'un transfert d'électrons entre les complexes soit possible.
Littérature
[1] Borgmann, S. ; Hartwich, G. ; Schulte, S. ; Schuhmann, W. ; « Capteurs enzymatiques ampérométriques basés sur le transfert d'électrons direct et médiatisé », Perspectives in Bioanalysis, 2005 (1), p. 599.
[2] Schuhmann, W. ; Électrodes enzymatiques ampérométriques à base de polymères conducteurs; Mikrochim. Acta, 1995 (121) ; p. 1