자체 제작 바이오센서로 포도당 검출 3/5 - 효소 바이오센서의 고정화

효소 바이오센서의 고정화

효소를 기반으로 하는 바이오센서는 직접 및 간접 전자 전달 시스템으로 나뉩니다. 직접 전자 전달은 전자가 효소의 활성 중심에서 전극으로 직접 전달되는 것을 의미합니다. 간접 전자 전달은 산화 환원 매개체 또는 효소 반응의 생성물을 사용하여 효소의 활성 중심과 전극 사이에서 전자를 운반합니다. 직접 전자 전달은 일단 확립되면 더 효율적이지만, 직접 전자 전달을 위해 효소를 고정하는 것은 매우 어렵습니다. 활성 중심은 절연 단백질 껍질 안에 있습니다. 일정 거리 이상에서는 전자 전달이 불가능해집니다. 이러한 조건은 마커스 이론[1]에 의해 설명됩니다. 직접 전자 전달이 가능한지 여부는 효소 구조에 따라 달라지며, 즉 효소 활성 중심 주위에 두꺼운 단백질 껍질이 있는 경우 직접 전자 전달이 불가능합니다.

흡착

오늘날 존재하는 수많은 고정화 방법이 이러한 어려움에도 불구하고 개발되었는지 아니면 이러한 어려움 때문에 개발되었는지는 말하기 어렵습니다. 생물학적 인식 요소를 고정하는 쉬운 방법은 일반 흡착입니다(그림 2.1 참조).

일부 전극 물질은 단백질과 충분히 강하게 상호작용하여 씻겨나가지 않습니다. 예를 들어, 많은 탄소 종은 π-π뿐만 아니라 반더발의 상호 작용과 종종 작용기의 혼합을 보여줍니다. 금 표면은 시스테인과 같은 황 함유 아미노산과 결합합니다. 이 기술은 수행하기가 매우 쉬워 특히 초기 연구 단계에서 많이 사용되지만, 흡착된 단백질은 이온 강도, 즉 용액 내 이온 수, pH 및 온도 변화에 민감하므로 조건이 변하면 표면에서 탈착될 수 있습니다. 전극 표면과 직접 접촉하면 흡착된 단백질이 변성될 가능성이 매우 높습니다. 효소에 적합한 환경을 조성하고 변성을 일으키지 않으며 전자 전달(매개 또는 직접)을 허용하는 단층으로 전극을 덮어 전극을 수정할 수 있습니다. 이러한 표면 변형의 예로는 금 전극에 자체 조립된 피리딘 티올 단층이 있습니다. 이 표면에 사이토크롬 c가 흡착되면 빈 전극에 비해 사이토크롬 c와 전극 사이의 전자 전달이 개선됩니다.

공유 결합

또 다른 기술은 단백질을 전극에 공유 결합하는 것입니다. 예를 들어, 자체 조립된 단층은 공유 결합을 만드는 데 필요한 작용기를 제공할 수 있습니다(그림 2.2 참조). 금 표면의 3-설파닐프로파노산 층은 황기와 함께 금 표면에 결합하여 자기조립 단층을 형성합니다. 카르복실기는 활성화되어 생물학적 인식 요소의 아민기와 결합된 에스테르를 형성하여 생물학적 인식 요소를 표면에 결합할 수 있습니다.

공유 결합은 안정적이며 고정화는 전극을 둘러싼 용액의 조건에 더 이상 민감하지 않습니다. 공유 결합에 사용되는 인식 요소에서 작용기의 위치를 알면 고정화 후 표면의 구조도 알 수 있고 정의할 수 있습니다. 공유 결합에 적합한 작용기를 생성하기 위해 전극 표면을 활성화하는 것은 종종 어려운 부분입니다.

흡착 및 공유 결합은 매개 및 직접 전자 전달 바이오센서에 적합합니다. 매개 전달은 효소 반응의 생성물이 매개체가 되거나 전극 표면에 공동 고정된 산화 환원 매개체가 필요합니다. 매개체가 고정되지 않은 경우, 시료 용액에 자유 확산 산화 환원 매개체를 추가해야 합니다.

폴리머 매트릭스의 함정

매우 다른 접근 방식은 폴리머 매트릭스에 효소를 포획하는 것입니다. 이 아이디어는 전극 표면에 어망처럼 내부에 효소가 포획된 폴리머 층을 만드는 것입니다. 효소는 폴리머가 효소 반응을 방해하지 않는 경우에만 작동할 수 있습니다. 폴리머가 효소를 변형시키거나, 분석 물질이 효소로 확산되는 것을 막거나, 효소로부터 효소 생성물이 확산되는 것을 막거나, 효소와 전극 사이의 매개체 이동을 막으면 바이오센서가 작동하지 않습니다. 폴리머는 매우 다양한 구조와 특성으로 생산되기 때문에 오늘날에는 많은 폴리머 기반 바이오 센서가 알려져 있습니다.

폴리머와 효소 매트릭스는 다양한 방식으로 전극에 적용할 수 있습니다. 매우 간단한 접근 방식은 드롭 코팅입니다. 폴리머와 효소는 유기 용매에 용해됩니다. 이 용액 한 방울을 작업 전극에 떨어뜨려 건조시킵니다(그림 2.3a 참조). 또 다른 방법은 특정 pH 범위의 수용액에만 용해되는 폴리머를 사용하는 것입니다.

폴리머와 효소 용액을 혼합한 후 전극을 폴리머 용액에 담근 다음 폴리머의 pH 범위를 벗어난 용액에 담급니다. 이 과정을 여러 번 반복합니다. 또 다른 옵션은 전극을 폴리머 용액에 담그고 높은 음극 또는 양극 전위를 적용하여 국부적으로만 pH를 변경하는 것입니다(그림 2.3b 참조). 폴리머는 전극 근처에서 침전됩니다.

전기 중합

또 다른 접근법은 효소가 있는 상태에서 중합체를 형성하기 위해 결합을 만드는 것입니다. 폴리머를 형성하는 분자를 단량체라고 합니다. 중합을 수행하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 일반적인 방법은 단량체가 이미 짧은 사슬(올리고머)을 형성하여 여전히 용해성이 있거나 적어도 현탁액을 형성하는 가교제를 첨가하는 것입니다. 가교제는 올리고머 사이에 결합을 형성하고 폴리머로 침전됩니다. 또 다른 우아한 방법은 전기 중합을 수행하는 것입니다. 단량체는 전극에 전위를 가하여 활성화됩니다. 활성화는 일반적으로 다른 단량체를 공격하여 이합체 라디칼을 생성하는 라디칼의 형성입니다. 이 과정은 폴리머가 용액에 너무 오래 머물러 침전될 때까지 반복됩니다(그림 2.4 참조).

이 기술의 일반적인 예는 폴리피롤의 형성입니다. 피롤의 장점은 단량체가 이합체, 삼량체 등에 비해 산화하기가 더 어렵기 때문에 새로운 사슬의 시작보다 사슬 길이가 늘어날 가능성이 더 높다는 것입니다[2]. 폴리피롤의 경우처럼 라디칼 반응을 사용하는 경우, 산소는 디라디칼이라는 특성으로 인해 라디칼 제거제이기 때문에 모노머 용액에서 산소를 제거하여 중합을 개선할 수 있습니다.

또한 폴리피롤은 전도성 폴리머라는 장점이 있습니다. 성장은 제한되지 않으며 인가된 전위 또는 전류와 인가된 시간에 따라 제어할 수 있습니다. 또한 전자를 전극으로 쉽게 전달할 수 있습니다. 비전도성 폴리머는 전극으로 이동하기 위해 효소 반응의 매개체 또는 전기화학적 활성 생성물이 필요하지만(그림 5a 참조), 전도성 폴리머는 매개체 또는 생성물을 효소에 가깝게 변환하여 전자를 운반할 수 있습니다. 이상적인 경우, 폴리머는 효소의 활성 중심으로부터 직접 전자를 수집할 수 있습니다. 이 경우 산화 환원 매개체도 용액에 첨가할 필요가 없습니다. 예를 들어 오스뮴과 같은 금속 복합체로 변형된 폴리머는 이러한 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이 폴리머에는 오스뮴 복합체가 포함되어 있으며, 이 복합체의 껍질은 효소의 활성 중심부로 확산되어 전자를 받아들이거나 기증할 수 있게 해줍니다. 전자는 전극에 도달할 때까지 복합체에서 복합체로 이동합니다(그림 2.5 b 참조). 물론, 복합체 사이의 거리와 유연성은 복합체 간의 전자 이동이 가능하도록 선택됩니다.

문학

[1] 보그만, S.; 하트위치, G.; 슐트, S.; 슈만, W.; 직접 및 매개 전자 전달에 기반한 전류 측정 효소 센서, 생물 분석의 관점, 2005 (1), 599쪽.
[2] 슈만, W.; 전도성 고분자 기반 전류 측정 효소 전극; Mikrochim. Acta, 1995 (121); p. 1