자체 제작 바이오센서 4/5로 포도당 감지 - Michaelis-Menten Kinetics

마이클리스-멘텐 상수

바이오센서를 특성화하려면 미카엘리스-멘텐 상수가 중요한 요소입니다. 이 상수가 중요한 이유와 그 유래를 이해하려면 미카엘리스-멘텐의 관찰과 이론을 이해해야 합니다. 이 모델은 여전히 효소 동역학에 가장 많이 사용되는 모델입니다. 효소 E는 효소에 의해 변환되는 시약의 용어인 기질 S를 생성물 P 또는 생성물로 변환하는 촉매입니다. 기질 선택적 반응을 수행하려면 기질과 효소가 복합체 ES를 형성해야 합니다. 이 반응의 제한 단계는 ES가 E와 P로 전환되는 과정이며 일반적으로 생성물 쪽의 평형이 매우 강합니다. 효소 반응은 다음과 같이 표현됩니다:

질량 작용 법칙에 따르면 복합체의 해리 상수_KS는 다음과 같습니다:

복합체에서 생성물로의 반응은 비가역적인 것으로 취급할 수 있지만, ES 형성의 동역학은 생성물 형성에 비해 빠르며 가역적입니다. 결과적으로 반응 속도 _vR은 다음에 따라 효소-기질 복합체의 농도에 비례합니다.

ES의 농도는 효소와 기질 농도에 따라 달라집니다. 고정된 양의 효소 용액을 가지고 기질 농도를 증가시키면서 속도를 관찰하면 포화 곡선이 관찰됩니다(그림 3.1 참조). 이는 기질 농도가 증가함에 따라 더 많은 E가 ES로 변환되기 때문에 발생합니다. 어느 시점에서 모든 E가 ES로 변환되고 기질을 더 이상 추가해도 더 이상 ES가 생성되지 않습니다.

잘 작동하는 비유는 모든 계산대가 열려 있는 슈퍼마켓입니다. 계산대가 5개이고 고객이 2명인 경우 2명의 고객이 30초 안에 결제할 수 있지만, 고객 수가 5명으로 늘어나면 5명의 고객이 30초 안에 결제할 수 있으므로 _vR (시간당 결제하는 고객 수)이 증가합니다. 예를 들어 10명으로 고객이 늘어나도 _vR은 증가하지 않지만 결제 시 대기열이 형성됩니다.

최대 속도 _vmax와 최저 농도 _vmax ([S_]max)는 중요한 정보를 포함하는 두 가지 매개 변수입니다. 반응 속도 또는 속도 v는 S가 P로 변환되는 빈도, 즉 전자가 효소로 전달되는 빈도를 결정합니다. 이러한 전자는 전극에서 직접 또는 간접적으로 기증되거나 수용되므로 측정 중 반응 속도는 측정된 전류로 표시됩니다. 즉, _vmax가 높을수록 농도당 전류가 높아지며 감도라고도 합니다._{최대 [S]} 는 전류가 [S]에 따라 달라지는 농도 범위를 결정합니다. S_]max가 매우 높으면 이 효소로 넓은 범위의 농도를 감지할 수 있습니다. 효소가 고정된 경우 [S_]max 및 _vmax는 자유 확산 중에 그 특성에 비해 변할 수 있습니다.

그러나 이러한 중요한 매개변수를 결정하는 것은 매우 어렵습니다. 마이클리스-멘텐 상수_KM을 도입하면 이 문제를 단순화할 수 있습니다. 포화도의 모양으로 인해 결정하기 어려운 _vmax를 사용하는 대신 0._5vmax를 기준으로 사용합니다. 지난 단락에서 설명한 ES와 _vR의 관계에 따르면, v가 0._5vmax인 경우 전체 효소 양의 절반이 ES로 존재합니다. 그림 3.1에서 볼 수 있듯이 0._5vmax에 대한 [S]의 농도는 마이클리스-멘텐 상수_KM입니다. 미카엘리스-멘텐 상수_KM은 기질 S와 효소 E 사이의 친화력이 얼마나 높은지를 나타냅니다. 또한 다음 단락에서 설명하는 선형 위버-버크 플롯을 사용하여_KM 및 _vmax의 값을 결정할 수 있습니다.

KM 및 vmax 결정

_KM이 중요한 이유를 배운 후 다음에서 방정식 3.2를 풀면 마이클리스-멘텐 상수_KM의 또 다른 흥미로운 속성을 발견할 수 있습니다.

이 시점에서 이전 장에서 알 수 있듯이 효소_Et의 총량 중 절반이 ES로 전환됩니다:

방정식 3.4와 3.5를 방정식 3.2에 삽입하면 다음과 같은 결과를 얻을 수 있습니다:

효소의 복소 상수_KS는 미카엘리스-멘텐 상수_KM인데, 이 특수한 경우와 일반적인 경우의 상수는 동일하기 때문입니다._KM을 측정하는 방법을 찾으려면 일반적인 경우, 즉 [S]의 모든 값에 대한 방정식 3.2를 살펴보고 이를 측정된 전류에 연결해야 합니다. 이전 장에서 알다시피 전류는 반응 속도 _vR에 따라 달라집니다. 방정식 3.3에서 우리는 이미 _vR과 [S] 사이의 관계를 알고 있으며, 모든 효소가 ES로 변환될 때 _vmax에 도달하기 때문에 더 흥미로운 _vmax와의 관계를 추론할 수 있습니다.

방정식 3.7은 이 결론을 보여줍니다. 방정식 3.6을 3.2와 함께 사용하면 [ES]에 대한 새로운 식이 나옵니다(방정식 3.8).

우리의 목표는 관심 있는 모든 매개변수와 측정값으로 확인할 수 있는 매개변수가 포함된 식입니다. 방정식 3.8에는 _vR이 포함되어 있지 않으며 전류와 상관관계가 있기 때문에 측정값과 연결하기 위해 vR이 필요합니다. 누락된 _vR은 방정식 3.3의 [ES]를 방정식 3.8로 대체하여 도입할 수 있습니다.

전류 측정 중에 기판 [S]의 농도를 제어할 수 있으며 _vR을 전류 I로 측정합니다. 방정식 3.9의 미지수는 우리가 평가하고자 하는 두 가지 값, 즉 _{vmax와KM입니다}. 과학자들은 방정식을 선형 형태로 바꾸는 것을 좋아하는데, 이는 종종 선형 적합을 통해 누락된 파라미터를 잘 결정할 수 있기 때문입니다. 방정식 3.9를 반전하면 선형 형태를 얻을 수 있습니다:

방정식 3.10은 선위버-버크 방정식으로 알려져 있습니다. Lineweaver-Burk 방정식에 따르면 _1/vR 대 1/[S]의 플롯은 교차점 _1/vmax와 기울기 _KM/vmax를 갖는 선을 제공해야 합니다. 이러한 플롯을 선위버-버크 플롯이라고 하지만 전류계 실험에서는 1/I가 1/[S] 대비 플롯됩니다(그림 3.2 참조).

미카엘리스-멘텐 상수_KM에 대한 지식은 또 다른 이점이 있습니다. 그림 3.1에서 처음의 포화도 곡선이 선형 관계에 가깝다는 것을 알 수 있습니다. 일반적으로 정량적 측정은 곡선의 이 선형 세그먼트에 있어야 합니다. 이 곡선은 최대_KM의 농도까지 선형으로 취급할 수 있습니다. 미카엘리스-멘텐 상수를 알면 바이오센서의 선형 범위도 알 수 있습니다._KM의 일반적인 값은 ^10-2 - ^10-6 mol/l입니다.