用自制生物传感器检测葡萄糖 3/5 - 固定酶生物传感器

酶生物传感器的固定化

基于酶的生物传感器分为直接电子转移系统和间接电子转移系统。直接电子转移是指电子直接从酶的活性中心转移到电极上，或从酶的活性中心转移到电极上。间接电子转移利用氧化还原介质或酶反应的产物在酶的活性中心和电极之间传输电子。直接电子传递一旦建立，效率会更高，但固定酶以进行直接电子传递却相当困难。活性中心位于绝缘的蛋白质外壳内。超过一定距离，电子转移就变得不可能。马库斯理论[1]描述了这一条件。能否进行直接电子转移取决于酶的结构，也就是说，如果酶的活性中心周围有一层厚厚的蛋白质外壳，就不可能进行直接电子转移。

吸附

很难说今天大量的固定化方法是在面临这些挑战的情况下还是因为这些挑战而发展起来的。固定生物识别元素的一种简便方法是普通吸附法（见图 2.1）。

有些电极材料与蛋白质的相互作用非常强烈，因此不会被洗掉。例如，许多碳元素都具有π-π和范-德-瓦尔相互作用，而且往往是多种官能团的混合作用。金表面与半胱氨酸等含硫氨基酸结合。虽然这种技术非常容易操作，因此尤其在最初的研究阶段很受欢迎，但被吸附的蛋白质对离子强度（即溶液中离子的数量、pH 值和温度）的变化很敏感，因此一旦条件发生变化，就会从表面脱附。与电极表面直接接触很可能导致吸附蛋白质变性。可以通过在电极表面覆盖一层单层膜对电极进行修饰，从而为酶创造一个合适的环境，既不会导致变性，又能实现电子转移（介导或直接转移）。金电极上的吡啶硫醇自组装单层就是这种表面修饰的一个例子。如果细胞色素 c 吸附在该表面上，与空白电极相比，细胞色素 c 与电极之间的电子传递会得到改善。

共价结合

另一种技术是将蛋白质与电极共价结合。例如，自组装单层可以提供必要的官能团来形成共价键（见图 2.2）。金表面的 3-硫丙酸层会与金表面的硫基结合，形成自组装单层。羧基可以活化，并与生物识别元素的胺基形成酯结合，从而将生物识别元素与金表面结合。

共价键是稳定的，固定过程对电极周围溶液的条件不再敏感。如果用于共价键的识别元件上的官能团位置已知，那么固定化后的表面结构也是已知和确定的。活化电极表面，为共价键创建合适的官能团往往是最困难的部分。

吸附和共价键适用于介导和直接电子转移生物传感器。介导转移需要酶反应的产物作为介质，或者在电极表面共同固定氧化还原介质。如果没有固定介质，则需要在样品溶液中加入自由扩散的氧化还原介质。

聚合物基质中的夹层

一种截然不同的方法是在聚合物基质中夹带酶。其原理是在电极表面形成一层聚合物，像渔网一样将酶夹在里面。只有在聚合物不干扰酶反应的情况下，酶才能发挥作用。如果聚合物使酶变形，阻止分析物向酶扩散，阻止酶的产物从酶扩散，或者阻止酶和电极之间的介质移动，生物传感器就无法工作。由于聚合物的结构和性质多种多样，目前已知的基于聚合物的生物传感器有很多。

聚合物和酶基质可以通过不同的方式涂覆到电极上。一种非常简单的方法是滴涂。聚合物和酶溶解在有机溶剂中。将该溶液滴在工作电极上，然后干燥（见图 2.3a）。另一种方法是使用只溶于特定 pH 值范围内水溶液的聚合物。

将聚合物和酶溶液混合后，将电极浸入聚合物溶液中，然后再浸入聚合物 pH 值范围以外的溶液中。如此反复多次。另一种方法是将电极浸入聚合物溶液中，通过施加较高的阴极或阳极电位，仅局部改变 pH 值（见图 2.3b）。聚合物将在电极附近析出。

电聚合

另一种方法是在酶的作用下产生键来形成聚合物。形成聚合物的分子称为单体。进行聚合的方法有很多种。一种常见的方法是加入交联剂溶液，在交联剂溶液中，单体已形成短链（低聚物），这些短链仍可溶解或至少形成悬浮液。交联剂在低聚物之间形成键合，使它们沉淀为聚合物。另一种有效的方法是进行电聚合。通过在电极上施加电位来激活单体。活化通常是形成一个自由基，该自由基攻击另一个单体，形成二聚自由基。这一过程不断重复，直到聚合物在溶液中停留时间过长而沉淀为止（见图 2.4）。

这种技术的一个常见例子就是聚吡咯的形成。吡咯的优点是单体比其二聚体、三聚体等更难氧化，因此链长增长比开始形成新链的可能性更大[2]。如果使用自由基反应，如聚吡咯，则可以通过去除单体溶液中的氧气来改善聚合反应，因为氧气具有二元自由基的性质，是自由基的清除剂。

此外，聚吡咯还具有导电聚合物的优点。其生长不受任何限制，可由施加的电位或电流以及施加的时间来控制。电子也很容易转移到电极上。非导电聚合物需要酶反应的介质或电化学活性产物才能到达电极（见图 5a），而导电聚合物则可以将介质或产物转化为靠近酶的电子，并将电子传输到电极上。在理想情况下，聚合物能够直接从酶的活性中心收集电子。在这种情况下，氧化还原介质也无需添加到溶液中。用金属络合物（如锇）修饰的聚合物已证明能够做到这一点。聚合物含有锇络合物，其外壳允许络合物扩散到酶的活性中心，接受或提供电子。电子会在络合物之间跳跃，直至到达电极（见图 2.5 b）。当然，络合物之间的距离和它们的柔性要以络合物之间可以进行电子转移为前提。

文学

[1] Borgmann, S.; Hartwich, G.; Schulte, S.; Schuhmann, W.;Amperometric Enzyme Sensors based on Direct and Mediated Electron Transfer, Perspectives in Bioanalysis, 2005 (1), p. 599.
[2] Schuhmann, W.;Conducting Polymer Based Amperometric Enzyme Electrodes; Mikrochim.Acta, 1995 (121); p. 1