用自制生物传感器检测葡萄糖 4/5 - 迈克尔斯-门顿动力学

迈克尔斯-门顿常数

要确定生物传感器的特性，Michaelis-Menten 常数是一个重要因素。要了解它的重要性和来源，就必须了解 Michaelis-Menten 的观察和理论。这一模型仍然是酶动力学中最常用的模型。酶 E 是一种催化剂，可将底物 S（酶转化的试剂）转化为产物 P 或多种产物。要进行底物选择性反应，底物和酶必须形成复合物 ES。可以假定 ES 的浓度与酶 E 和底物 S 处于动态平衡状态。该反应的限制步骤是 ES 向 E 和 P 的转化，通常产物一方的平衡非常强。酶促反应用以下公式表示

根据质量作用定律，复合物的解离常数_KS为

虽然从复合物到产物的反应可视为不可逆反应，但 ES 的形成动力学比产物的形成快，是可逆的。因此，反应速度_vR与酶-底物复合物的浓度成正比。

ES 的浓度取决于酶和底物的浓度。如果我们有固定量的酶溶液，并在增加底物浓度时观察速度，就会观察到饱和曲线（见图 3.1）。这是因为随着底物浓度的增加，更多的 E 转化为 ES。在某一点上，所有的 E 都转化成了 ES，再添加底物也不会产生更多的 ES。

一个行之有效的比喻是，一家超市的所有收银台都是开放的。如果有 5 个收银台和 2 个顾客，2 个顾客可以在 30 秒内付款。如果顾客数量增加到 5 个，5 个顾客可以在 30 秒内付款，即速度_vR（每次结账的顾客数量）增加。更多的顾客，例如 10 个，不会增加_vR，但结账处会出现排队现象。

最大速度_vmax和具有_vmax的最低浓度（[S_]max）是两个包含重要信息的参数。反应速率或速度 v 决定了 S 转化为 P 的频率，从而决定了电子转移到酶的频率。由于这些电子将直接或间接地捐献给电极或被电极接受，因此测量过程中的反应速率由测量到的电流表示。这意味着_vmax越高，单位浓度的电流就越大，也称为灵敏度。[S_]max决定了电流取决于 [S] 的浓度范围。如果[S_]max很高，则该酶可检测的浓度范围就很大。如果酶被固定，[S_]max和_vmax与自由扩散时的特性相比可能会发生变化。

然而，确定这些重要参数非常困难。引入迈克尔斯-门顿常数_KM 可以简化这一问题。由于饱和度的形状，_vmax很难确定，因此可以使用 0._5vmax作为参考，而不是使用 vmax。根据上一段讨论的 ES 和_vR之间的关系，如果 v 为 0.₅vmax，则酶总量的一半作为 ES 存在。如图 3.1 所示，0.₅vmax 时的[S]浓度即为迈克尔斯-门顿常数_KM。迈克尔斯-门顿常数_KM表明底物 S 与酶 E 之间的亲和力有多高。此外，_KM和_vmax的值还可以用 Lineweaver-Burke-plot 来确定。

确定 KM 和 vmax

在了解了_KM为何重要之后，我们还可以通过解方程 3.2 发现迈克尔斯-门顿常数_KM的另一个有趣性质，即："......"。

从上一章我们可以知道，此时酶_Et总量的一半转化为 ES：

将公式 3.4 和 3.5 插入公式 3.2，我们会发现

酶的复合常数_KS就是迈克尔斯-门顿常数_KM，因为在特殊情况和一般情况下，常数是相同的。为了找到测量_KM 的方法，我们需要研究一般情况下的方程 3.2，即任何 [S] 值，并将其与测量到的电流联系起来。正如我们在前一章中所知道的，电流取决于反应速率_vR。根据公式 3.3，我们已经知道_vR和 [S] 之间的联系，并且可以推导出与更有趣的_vmax 之间的联系，因为当所有酶都转化为 ES 时，就达到了_vmax。

方程 3.7 显示了这一结论。将方程 3.6 与 3.2 结合使用，可以得到 [ES] 的新表达式（方程 3.8）。

我们的目标是得到一个表达式，其中包含我们感兴趣的所有参数以及我们可以通过测量确定的参数。方程 3.8 不包括_vR，我们需要它来与我们的测量建立联系，因为它与电流相关。将方程 3.3 中的 [ES] 代入方程 3.8，即可引入缺失的_vR。

在安培测量过程中，我们可以控制底物 [S] 的浓度，测量_vR即电流 I。方程 3.9 中的未知值就是我们要评估的两个值：_vmax和_KM。科学家们喜欢将方程转化为线性形式，因为这通常可以通过线性拟合很好地确定缺失的参数。如果将方程 3.9 倒置，就可以得到线性形式：

公式 3.10 被称为 Lineweaver-Burk 方程。根据 Lineweaver-Burk 方程，1/_vR与 1/[S]的关系曲线应为交点为 1/_vmax、斜率为_KM/vmax 的直线。这样的曲线图称为 Lineweaver-Burk 曲线图，但在安培实验中，1/I 与 1/[S] 的关系曲线图（见图 3.2）。

了解 Michaelis-Menten 常数_KM还有另一个好处。从图 3.1 中可以看出，开始时的饱和曲线接近于线性关系。通常情况下，定量测量需要在曲线的这一段线性范围内进行。可以将_KM 浓度以下的曲线视为线性关系。如果 Michaelis-Menten 常数是已知的，那么生物传感器的线性范围也是已知的。_KM的典型值在 ^10-2- ^10-6 摩尔/升之间。