自作バイオセンサーによるグルコース検出 3/5 - 酵素バイオセンサーの固定化

酵素バイオセンサーの固定化

酵素を利用したバイオセンサーは、直接電子伝達系と間接電子伝達系に分けられる。直接電子移動とは、電子が酵素の活性中心から、あるいは活性中心へ直接電極に移動することを意味する。間接的電子伝達は、酸化還元メディエーターまたは酵素反応の生成物を用いて、酵素の活性中心と電極の間で電子を輸送する。一度確立された直接電子移動はより効率的だが、直接電子移動のために酵素を固定化するのはかなり難しい。活性中心は絶縁性のタンパク質の殻の中にある。ある距離を超えると電子伝達は不可能になる。この条件はMarcus理論[1]によって説明される。直接電子移動が可能かどうかは酵素の構造に依存する。つまり、酵素が活性中心の周りに厚いタンパク質の殻を持っている場合、直接電子移動は不可能である。

吸着

今日存在する多くの固定化方法が、このような課題にもかかわらず開発されたのか、あるいは課題があったからこそ開発されたのかは、一概には言えない。生物学的認識素子を固定化する簡単な方法は、単純な吸着である（図2.1参照）。

電極材料の中には、タンパク質と強く相互作用し、洗い流されないものがある。例えば、多くの炭素種は、π-π相互作用だけでなく、van-der-Waalの相互作用も示し、多くの場合、官能基が混在している。金表面はシステインのような含硫アミノ酸と結合する。この手法は非常に簡単であるため、特に最初の研究段階ではよく用いられるが、吸着したタンパク質はイオン強度の変化、すなわち溶液中のイオン数、pH、温度の変化に敏感であるため、条件が変わると表面から脱離する可能性がある。電極表面との直接接触は、吸着タンパク質の変性を引き起こす可能性が非常に高い。酵素に適した環境を作り出し、変性を起こさず、電子移動（媒介または直接）を可能にする単分子膜で電極を覆うことで、電極を修飾することが可能である。このような表面修飾の例は、金電極上のピリジンチオールの自己組織化単分子膜である。その表面にシトクロムcを吸着させると、シトクロムcと電極間の電子移動が、何もない電極に比べて改善される。

共有結合

もう一つの手法は、タンパク質を電極に共有結合させることである。例えば自己組織化単分子膜は、共有結合を形成するのに必要な官能基を提供できる（図2.2参照）。金表面上の3-スルファニルプロパン酸層は、硫黄基で金表面に結合し、自己組織化単分子膜を形成する。カルボキシル基は活性化することができ、生物学的認識要素のアミン基と結合してエステルを形成し、生物学的認識要素を表面に結合させる。

共有結合は安定であり、固定化は電極周囲の溶液の状態にはもう影響されない。共有結合に使用される認識要素の官能基の位置が既知であれば、固定化後の表面の構造も既知で定義される。共有結合に適した官能基を作るために電極表面を活性化することは、しばしば難しい部分である。

吸着と共有結合は、媒介および直接電子移動バイオセンサーに適している。メディエーターは、酵素反応の生成物をメディエーターとするか、電極表面に酸化還元メディエーターを共固定化する必要がある。メディエーターが固定化されていない場合は、自由拡散性の酸化還元メディエーターをサンプル溶液に加える必要がある。

ポリマーマトリックスへの封入

全く異なるアプローチは、ポリマーマトリックスに酵素を封じ込めることである。このアイデアは、電極表面にポリマーの層を作り、魚網のように内部に酵素を取り込むことである。酵素は、ポリマーが酵素反応を妨げない場合にのみ働くことができる。ポリマーが酵素を変形させたり、酵素への分析物の拡散や酵素からの生成物の拡散、酵素と電極間のメディエーターの移動を阻害したりすると、バイオセンサーは機能しない。ポリマーは非常に多様な構造と性質を持つため、現在では多くのポリマーベースのバイオセンサーが知られている。

ポリマーと酵素マトリックスは様々な方法で電極に塗布することができる。非常に簡単な方法はドロップコーティングである。ポリマーと酵素を有機溶媒に溶かす。この溶液を作用電極上に滴下し、乾燥させる（図 2.3a 参照）。もう一つの方法は、あるpH範囲の水溶液にしか溶けないポリマーを使うことである。

ポリマーと酵素溶液を混合した後、電極をポリマー溶液に浸し、次にポリマーのpH範囲外の溶液に浸す。これを何度か繰り返す。もう一つの方法は、電極をポリマー溶液に浸し、高いカソード電位またはアノード電位を印加することで、局所的にのみpHを変化させる方法である（図2.3b参照）。ポリマーは電極近傍で沈殿する。

電解重合

もう一つのアプローチは、酵素の存在下でポリマーを形成する結合を作ることである。ポリマーを形成する分子はモノマーと呼ばれる。重合を行うにはさまざまな方法がある。一般的な方法は、モノマーがすでに短い鎖（オリゴマー）を形成しており、まだ可溶性であるか、少なくとも懸濁液を形成している架橋剤溶液を添加することである。架橋剤はオリゴマー間に結合を形成し、ポリマーとして析出する。もうひとつのエレガントな方法は、電解重合である。モノマーは電極に電位をかけることで活性化される。活性化は通常ラジカルの形成であり、このラジカルが別のモノマーを攻撃して二量体ラジカルを生成する。このプロセスは、ポリマーが溶液中に長く留まらなくなって沈殿するまで繰り返される（図2.4参照）。

この技術の一般的な例は、ポリピロールの形成である。ピロールの利点は、モノマーが二量体や三量体などに比べて酸化されにくいため、新しい鎖が始まるよりも鎖長が伸びる可能性が高いことである[2]。ポリピロールの場合のようにラジカル反応を用いる場合、モノマー溶液から酸素を除去することで重合を改善することができる。

さらに、ポリピロールは導電性ポリマーであるという利点がある。成長には制限がなく、印加する電位や電流、時間によって制御できる。また、電極への電子の移動も容易である。非伝導性ポリマーが電極まで移動するには、メディエーターや酵素反応の電気化学的活性産物が必要であるのに対し（図5a参照）、伝導性ポリマーはメディエーターや産物を酵素の近くで変換し、電子を輸送することができる。理想的なケースでは、ポリマーは酵素の活性中心から直接電子を集めることができる。この場合、酸化還元メディエーターも溶液に加える必要はない。例えばオスミウムのような金属錯体で修飾されたポリマーは、これが可能であることが示されている。このポリマーはオスミウム錯体を含んでおり、その殻によって錯体が酵素の活性中心に拡散し、電子を受容したり供与したりする。電子は電極に到達するまで、錯体から錯体へとホップする（図2.5 b参照）。もちろん、錯体間の距離とその柔軟性は、錯体間の電子移動が可能なように選択される。

文献

[1] Borgmann, S.; Hartwich, G.; Schulte, S.; Schuhmann, W.; 「直接および媒介された電子移動に基づくアンペロメトリック酵素センサー」、Perspectives in Bioanalysis、2005 (1)、p. 599。
[2] Schuhmann, W.;導電性ポリマーを用いたアンペロメトリック酵素電極; Mikrochim. Acta, 1995 (121); p. 1