Nachweis von Wasserstoffperoxid 5/5 - Die Kalibrierkurve
Dieses Kapitel ist Teil der Reihe „Nachweis von Wasserstoffperoxid mit Preußischblau“. In diesem Kapitel wird erläutert, wie eine Kalibrierungskurve erstellt und verwendet wird.
Linearität
Bei jedem Messgerät muss ein bekannter Zusammenhang zwischen dem Signal (z. B. absorbiertes Licht, emittiertes Licht, Strom, Spannung, Temperaturänderung usw.) und der zu erfassenden Eigenschaft (z. B. Konzentration einer Substanz, Leitfähigkeit, spezifische Absorption) bestehen. Am einfachsten zu handhaben ist eine lineare Funktion. Sie hat eine bekannte Gleichung, und eine Kalibrierung lässt sich mit nur zwei Referenzpunkten durchführen. Ist bekannt, dass eine lineare Funktion durch den Punkt 0 verläuft, reicht sogar ein einziger Punkt aus. Die Gleichungen für eine lineare Anpassung sind ebenfalls allgemein bekannt und lassen sich heutzutage sogar mit Taschenrechnern berechnen. Daher wird in der Regel eine lineare Beziehung verwendet, um den Wert der gewünschten Eigenschaft aus einem Messwert zu berechnen.
Viele Sensoren verfügen über einen definierten linearen Messbereich. Dabei handelt es sich um Grenzwerte, innerhalb derer der Sensor eine lineare Beziehung zwischen dem Signal und der gewünschten Eigenschaft anzeigt. Es gibt verschiedene Gründe, warum das Signal außerhalb dieses Bereichs nicht mehr linear ist. Zwei sehr häufige Beispiele sind Biosensoren auf Enzymbasis und pH-Elektroden auf Glasmembranbasis.
Biosensoren
Stellen Sie sich vor, dass eine Biosensoroberfläche eine feste Menge an EnzymmolekülennE aufweist. Durch Diffusion gelangt jede Sekunde eine Menge an EnzymsubstratennS an die Oberfläche. Angenommen, jedes Enzymmolekül reagiert in einer Sekunde mit einem Substratmolekül, führt ein Anstieg vonnS zu einem Anstieg der verbrauchten Substrate, solangenE >nS gilt. Angenommen, jedes Substratmolekül überträgt Elektronen an die Enzyme, die wiederum an die Elektrode weitergeleitet werden, lässt sich bei steigendemnS ein Anstieg des Stroms beobachten. SobaldnE <nS ist, müssen sich die Substratmoleküle vor den Enzymen „anstellen“, wie an einer Supermarktkasse. Der Strom steigt dann nicht mehr mitnS an, da die Enzyme gesättigt sind.
Daraus ergibt sich eine Sättigungskurve (siehe Abbildung 4.1a). Bitte beachten Sie, dass es sich hierbei um ein vereinfachtes Modell handelt und es noch einige weitere Effekte gibt, die die Kurve beeinflussen. Die Untergrenze des linearen Bereichs wird in der Regel durch die Nachweisgrenze definiert, beispielsweise wenn das Signal so klein ist, dass es im Rauschen untergeht.
Die pH-Elektrode basiert auf der Spannung an einer Glasmembran, die durch eine unterschiedliche Menge an Protonen entsteht, die an den Seiten der Glasmembran adsorbiert sind. Wenn der pH-Wert zu hoch wird, sind nicht genügend H+-Ionenvorhanden, und Na+-Ionen nehmen deren Platz ein. Na+-Ionen werden somit zu einer erheblichen Störgröße. Bei sehr niedrigen pH-Werten sind nicht genügend Wassermoleküle vorhanden, um die Membran in dem gequollenen Zustand zu halten, der erforderlich ist, um einen Potentialunterschied über die Membran hinweg aufzubauen. Beide Fälle führen zu einer Abweichung vom linearen Verhalten (siehe Abbildung 4.1b).
Erstellung einer Kalibrierkurve
Ein Sensor sollte so konstruiert sein, dass die Kalibrierungskurve zum Zeitpunkt der Analyse stabil ist. Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Verunreinigungen an den Sensorelementen sowie der Verlust des Katalysators oder des biologischen Erkennungselements können zu einer abweichenden Kalibrierung führen. Um ein zuverlässiges Ergebnis zu gewährleisten, müssen die Kalibrierungskurven nach bestimmten Zeiträumen neu bewertet werden. Der Zeitraum hängt vom jeweiligen Sensor ab.
Eine Kalibrierungskurve wird in der Regel durch die Messung einer Reihe von Standardlösungen erstellt, die den gesamten linearen Messbereich des Sensors abdecken, sofern dieser bekannt ist, oder zumindest den Bereich der erwarteten Konzentrationen der Proben.
Anschließend wird eine lineare Anpassung durchgeführt (siehe Abbildung 4.2). Früher wurde die Gerade manuell eingezeichnet, indem man beurteilte, welche Linie am besten passte. Computer führen eine lineare Anpassung nach den Prinzipien der kleinsten Quadrate sehr schnell und präzise durch. Ziel dieser Berechnung ist es, die Gerade zu finden, die die geringste Summe der quadrierten Abweichungen zwischen den Messpunkten und der Geraden aufweist. Eine vollständige Herleitung der Gleichungen würde den Rahmen dieses Handbuchs sprengen. Im Folgenden werden die erforderlichen Gleichungen sehr kurz vorgestellt. Die allgemeine Form einer Geraden lautet:
Um die Kalibrierungskurve zu ermitteln, müssen die Werte der Steigung m und des y-Achsenabschnitts b bestimmt werden. Werden eine Reihe von PunktenP1(x1/y1),P2(x2/y2), …Pn(xn/yn) gemessen, so wird die Steigung der Kurve, die die geringste Abweichung von den gemessenen Punkten aufweist, gemäß folgender Formel berechnet:
und der y-Achsenabschnitt b gemäß
Auch wenn diese Gleichungen kompliziert erscheinen, handelt es sich im Grunde nur um viele verschiedene Summen, was zu zahlreichen mühsamen Berechnungen führt, und sie haben nichts mit höherer Mathematik zu tun. Perfekte Aufgaben für einen Computer. Die meisten Programme geben zudem die Fehlerwerte von a und b sowie den Korrelationskoeffizienten R² an. In der Regel reicht es aus zu wissen, dass R² ein Indikator für die Qualität der Kurve ist. Liegen alle Messpunkte auf einer perfekten Geraden, beträgt R² 1. Je größer der Abstand zwischen den Punkten und der Geraden ist, desto kleiner ist R². R² beweist keine echte lineare Korrelation. Es zeigt lediglich, wie gut diese Punkte an die berechnete Gerade angepasst sind. Selbst wenn der R²-Wert bei einer Messung von Neugeborenen im Vergleich zur Storchpopulation 1 beträgt, besteht dennoch kein kausaler Zusammenhang.