Nachweis von Glukose mit einem selbst hergestellten Biosensor 3/5 - Immobilisierung von enzymatischen Biosensoren

Immobilisierung von enzymatischen Biosensoren

Enzymbasierte Biosensoren werden in Systeme mit direktem und indirektem Elektronentransfer unterteilt. Ein direkter Elektronentransfer bedeutet, dass die Elektronen direkt vom oder zum aktiven Zentrum des Enzyms zur Elektrode übertragen werden. Bei einem indirekten Elektronentransfer werden ein Redoxmediator oder das Produkt der enzymatischen Reaktion genutzt, um Elektronen zwischen dem aktiven Zentrum des Enzyms und der Elektrode zu transportieren. Der direkte Elektronentransfer ist, sobald er einmal etabliert ist, effizienter, jedoch ist die Immobilisierung eines Enzyms für den direkten Elektronentransfer recht schwierig. Das aktive Zentrum befindet sich innerhalb einer isolierenden Proteinhülle. Ab einer bestimmten Entfernung wird der Elektronentransfer unmöglich. Die Bedingungen werden durch die Marcus-Theorie [1] beschrieben. Ob ein direkter Elektronentransfer möglich ist, hängt von der Enzymstruktur ab; das heißt, wenn das Enzym eine dicke Proteinhülle um das aktive Zentrum herum aufweist, ist ein direkter Elektronentransfer nicht möglich.

Adsorption

Es lässt sich schwer sagen, ob die Vielzahl der heute verfügbaren Immobilisierungsmethoden trotz oder gerade wegen dieser Herausforderungen entwickelt wurde. Eine einfache Methode zur Immobilisierung biologischer Erkennungselemente ist die einfache Adsorption (siehe Abbildung 2.1).

Einige Elektrodenmaterialien gehen so starke Wechselwirkungen mit Proteinen ein, dass diese nicht ausgewaschen werden. Beispielsweise weisen viele Kohlenstoffverbindungen sowohl π-π- als auch van-der-Waals-Wechselwirkungen auf und verfügen oft über eine Mischung aus funktionellen Gruppen. Goldoberflächen binden schwefelhaltige Aminosäuren wie Cystein. Obwohl diese Technik sehr einfach durchzuführen und daher insbesondere in den ersten Forschungsschritten beliebt ist, reagieren die adsorbierten Proteine empfindlich auf Änderungen der Ionenstärke – also der Anzahl der Ionen in der Lösung –, des pH-Werts sowie der Temperatur und können daher bei einer Veränderung der Bedingungen von der Oberfläche desorbieren. Der direkte Kontakt mit einer Elektrodenoberfläche führt mit hoher Wahrscheinlichkeit zur Denaturierung des adsorbierten Proteins. Es ist möglich, die Elektrode zu modifizieren, indem man sie mit einer Monoschicht überzieht, die eine geeignete Umgebung für das Enzym schafft, keine Denaturierung verursacht und den Elektronentransfer (vermittelt oder direkt) ermöglicht. Ein Beispiel für eine solche Oberflächenmodifikation ist eine selbstorganisierte Monoschicht aus Pyridinthiol auf einer Goldelektrode. Wird Cytochrom c an diese Oberfläche adsorbiert, verbessert sich der Elektronentransfer zwischen Cytochrom c und der Elektrode im Vergleich zu einer Blankoelektrode.

Kovalente Bindung

Eine weitere Technik ist die kovalente Bindung der Proteine an die Elektrode. Selbstorganisierte Monoschichten können beispielsweise die notwendigen funktionellen Gruppen bereitstellen, um eine kovalente Bindung herzustellen (siehe Abbildung 2.2). Eine Schicht aus 3-Sulfanylpropansäure auf einer Goldoberfläche bindet sich über die Schwefelgruppe an die Goldoberfläche und bildet eine selbstorganisierte Monoschicht. Die Carboxylgruppen können aktiviert werden und bilden eine Esterbindung mit den Amingruppen biologischer Erkennungselemente, wodurch das biologische Erkennungselement an die Oberfläche gebunden wird.

Eine kovalente Bindung ist stabil, und die Immobilisierung reagiert nicht mehr empfindlich auf die Bedingungen der die Elektrode umgebenden Lösung. Ist die Position der funktionellen Gruppe am Erkennungselement, die für die kovalente Bindung genutzt wird, bekannt, so ist auch die Architektur der Oberfläche nach der Immobilisierung bekannt und definiert. Die Aktivierung der Elektrodenoberfläche zur Bildung einer geeigneten funktionellen Gruppe für die kovalente Bindung stellt oft die größte Herausforderung dar.

Adsorption und kovalente Bindung eignen sich für Biosensoren mit vermitteltem und direktem Elektronentransfer. Für einen vermittelten Elektronentransfer müssen entweder die Produkte der enzymatischen Reaktion als Mediator dienen oder ein mitimmobilisierter Redoxmediator auf der Elektrodenoberfläche vorhanden sein. Ist kein Mediator immobilisiert, muss der Probenlösung ein frei diffundierender Redoxmediator zugesetzt werden.

Einschluss in einer Polymermatrix

Ein ganz anderer Ansatz ist die Einlagerung eines Enzyms in eine Polymermatrix. Die Idee besteht darin, auf der Elektrodenoberfläche eine Polymerschicht zu erzeugen, in der Enzyme wie in einem Fischernetz eingeschlossen sind. Das Enzym kann nur funktionieren, wenn das Polymer die enzymatische Reaktion nicht beeinträchtigt. Wenn das Polymer das Enzym verformt, die Diffusion des Analyten zum Enzym, die Diffusion der Enzymprodukte vom Enzym weg oder die Bewegung des Mediators zwischen dem Enzym und der Elektrode blockiert, funktioniert der Biosensor nicht. Da Polymere mit einer enormen Vielfalt an Strukturen und Eigenschaften hergestellt werden, sind heutzutage zahlreiche polymerbasierte Biosensoren bekannt.

Die Polymer- und Enzymmatrix kann auf verschiedene Weise auf die Elektrode aufgebracht werden. Ein sehr einfacher Ansatz ist das Tropfenbeschichten. Das Polymer und das Enzym werden in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Ein Tropfen dieser Lösung wird auf die Arbeitselektrode aufgebracht und getrocknet (siehe Abbildung 2.3a). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, ein Polymer zu verwenden, das nur in einem bestimmten pH-Bereich in wässriger Lösung löslich ist.

Nach dem Vermischen von Polymer- und Enzymlösung wird die Elektrode in die Polymerlösung und anschließend in eine Lösung außerhalb des pH-Bereichs des Polymers getaucht. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Elektrode in die Polymerlösung einzutauchen und den pH-Wert nur lokal durch Anlegen eines hohen kathodischen oder anodischen Potentials zu verändern (siehe Abbildung 2.3b). Das Polymer fällt dann in der Nähe der Elektrode aus.

Elektropolymerisation

Ein weiterer Ansatz besteht darin, in Gegenwart des Enzyms Bindungen zu bilden, um das Polymer zu bilden. Die Moleküle, aus denen das Polymer entsteht, werden als Monomere bezeichnet. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Polymerisation durchzuführen. Eine gängige Methode ist die Zugabe einer Vernetzerlösung, in der die Monomere bereits kurze Ketten (Oligomere) gebildet haben, die noch löslich sind oder zumindest eine Suspension bilden. Die Vernetzer bilden Bindungen zwischen den Oligomeren, woraufhin diese als Polymer ausfallen. Eine weitere elegante Methode ist die Elektropolymerisation. Das Monomer wird durch Anlegen einer Spannung an die Elektrode aktiviert. Die Aktivierung erfolgt in der Regel durch die Bildung eines Radikals, das ein anderes Monomer angreift, wodurch ein Dimer-Radikal entsteht. Der Vorgang wird so lange wiederholt, bis das Polymer zu lang ist, um in Lösung zu bleiben, und ausfällt (siehe Abbildung 2.4).

Ein gängiges Beispiel für diese Technik ist die Bildung von Polypyrrol. Der Vorteil von Pyrrol besteht darin, dass das Monomer schwerer zu oxidieren ist als seine Dimere, Trimere usw., sodass ein Wachstum der Kettenlänge wahrscheinlicher ist als der Beginn einer neuen Kette [2]. Wird, wie im Fall von Polypyrrol, eine Radikalreaktion genutzt, lässt sich die Polymerisation verbessern, indem Sauerstoff aus der Monomerlösung entfernt wird, da Sauerstoff aufgrund seiner Eigenschaft als Diradikal ein Radikalfänger ist.

Darüber hinaus hat Polypyrrol den Vorteil, dass es ein leitfähiges Polymer ist. Das Wachstum ist nicht begrenzt und lässt sich durch die angelegte Spannung oder den angelegten Strom sowie die Dauer der Anwendung steuern. Die Elektronen können zudem leicht zur Elektrode übertragen werden. Während nichtleitende Polymere einen Mediator oder ein elektrochemisch aktives Produkt der enzymatischen Reaktion benötigen, das zur Elektrode wandert (siehe Abbildung 5a), kann ein leitfähiges Polymer den Mediator oder das Produkt in der Nähe des Enzyms umwandeln und die Elektronen transportieren. Im Idealfall ist das Polymer in der Lage, die Elektronen direkt aus dem aktiven Zentrum des Enzyms aufzunehmen. In diesem Fall muss der Redoxmediator der Lösung auch nicht zugesetzt werden. Polymere, die mit Metallkomplexen – beispielsweise Osmium – modifiziert sind, haben gezeigt, dass sie dazu in der Lage sind. Das Polymer enthält einen Osmiumkomplex, dessen Hülle es dem Komplex ermöglicht, in das aktive Zentrum des Enzyms zu diffundieren und Elektronen aufzunehmen oder abzugeben. Die Elektronen springen von Komplex zu Komplex, bis sie die Elektrode erreichen (siehe Abbildung 2.5 b). Natürlich werden der Abstand zwischen den Komplexen und deren Flexibilität so gewählt, dass ein Elektronentransfer zwischen den Komplexen möglich ist.

Literatur

[1] Borgmann, S.; Hartwich, G.; Schulte, S.; Schuhmann, W.; Amperometrische Enzymsensoren auf Basis direkter und vermittelter Elektronenübertragung, Perspectives in Bioanalysis, 2005 (1), S. 599.
[2] Schuhmann, W.; Amperometrische Enzymelektroden auf Basis leitfähiger Polymere; Mikrochim. Acta, 1995 (121); S. 1