Nachweis von Glukose mit einem selbstgebauten Biosensor 4/5 - Michaelis-Menten-Kinetik

Michaelis-Menten-Konstante

Zur Charakterisierung von Biosensoren ist die Michaelis-Menten-Konstante ein wichtiger Faktor. Um zu verstehen, warum sie wichtig ist und woher sie stammt, muss man die Beobachtungen und Theorien von Michaelis-Menten verstehen. Dieses Modell ist nach wie vor das am häufigsten verwendete für die Enzymkinetik. Ein Enzym E ist ein Katalysator, der sein Substrat S – ein Begriff für den vom Enzym umgewandelten Reaktionsstoff – in das Produkt P oder in Produkte umwandelt. Um eine substratselektive Reaktion durchzuführen, müssen das Substrat und das Enzym einen Komplex ES bilden. Man kann davon ausgehen, dass die Konzentration von ES in einem dynamischen Gleichgewicht mit dem Enzym E und dem Substrat S steht. Der begrenzende Schritt bei dieser Reaktion ist die Umwandlung von ES in E und P, und in der Regel ist das Gleichgewicht auf der Produktseite sehr stark. Die enzymatische Reaktion lässt sich wie folgt ausdrücken:

Nach dem Gesetz der Massenwirkung lautet die Dissoziationskonstante_KS des Komplexes:

Während die Reaktion vom Komplex zum Produkt als irreversibel betrachtet werden kann, verläuft die Kinetik der ES-Bildung im Vergleich zur Produktbildung schnell und ist reversibel. Folglich ist die Reaktionsgeschwindigkeit_vR proportional zur Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes gemäß

Die Konzentration von ES hängt von der Enzym- und Substratkonzentration ab. Verfügt man über eine feste Menge an Enzymlösung und beobachtet die Reaktionsgeschwindigkeit bei steigender Substratkonzentration, so lässt sich eine Sättigungskurve feststellen (siehe Abbildung 3.1). Dies geschieht, weil mit steigender Substratkonzentration mehr E in ES umgewandelt wird. Ab einem bestimmten Punkt ist das gesamte E in ES umgewandelt, und eine weitere Zugabe des Substrats führt nicht mehr zur Bildung von ES.

Eine gut passende Analogie ist ein Supermarkt, in dem alle Kassen geöffnet sind. Wenn es 5 Kassen und 2 Kunden gibt, können 2 Kunden in 30 s bezahlen. Wenn die Anzahl der Kunden auf 5 erhöht wird, können 5 Kunden in 30 s bezahlen, das heißt, die Geschwindigkeit_vR (Anzahl der abgefertigten Kunden pro Zeiteinheit) erhöht sich. Bei mehr Kunden, zum Beispiel 10, steigt die_vR nicht weiter an, aber es bilden sich Warteschlangen an den Kassen.

Die maximale Geschwindigkeit_vmax und die niedrigste Konzentration bei_vmax ([S]_max) sind zwei Parameter, die wichtige Informationen enthalten. Die Reaktionsgeschwindigkeit v bestimmt, wie oft S in P umgewandelt wird und somit, wie oft Elektronen an das Enzym übertragen werden. Da diese Elektronen direkt oder indirekt von der Elektrode abgegeben oder aufgenommen werden, wird die Reaktionsgeschwindigkeit während der Messung durch den gemessenen Strom dargestellt. Das bedeutet: Je höher_vmax ist, desto höher ist der Strom pro Konzentration, was auch als Empfindlichkeit bezeichnet wird. [S]_max bestimmt den Konzentrationsbereich, in dem der Strom von [S] abhängt. Ist [S]_max sehr hoch, kann mit diesem Enzym ein großer Konzentrationsbereich erfasst werden. Ist ein Enzym immobilisiert, können sich [S]_max und_vmax im Vergleich zu ihren Eigenschaften bei freier Diffusion ändern.

Es ist jedoch sehr schwierig, diese wichtigen Parameter zu bestimmen. Dieses Problem lässt sich durch die Einführung der Michaelis-Menten-Konstante_KM vereinfachen. Anstelle von_vmax, das aufgrund der Form der Sättigung schwer zu bestimmen ist, wird 0,_5vmax als Referenzwert verwendet. Gemäß der im letzten Absatz erörterten Beziehung zwischen ES und_vR liegt die Hälfte der gesamten Enzymmenge als ES vor, wenn v 0,_5vmax beträgt. Die Konzentration von [S] bei 0,_5vmax entspricht der Michaelis-Menten-Konstante_KM, wie in Abbildung 3.1 zu sehen ist. Die Michaelis-Menten-Konstante_KM gibt an, wie hoch die Affinität zwischen dem Substrat S und dem Enzym E ist. Zudem lassen sich die Werte von_KM und_vmax mithilfe des Lineweaver-Burke-Diagramms bestimmen, das im folgenden Absatz erläutert wird.

Bestimmen Sie KM und vmax

Nachdem man gelernt hat, warum_KM wichtig ist, kann man eine weitere interessante Eigenschaft der Michaelis-Menten-Konstante_KM entdecken, indem man die Gleichung 3.2 wie folgt löst

Wie wir aus dem vorigen Kapitel wissen, ist zu diesem Zeitpunkt die Hälfte der gesamten Enzymmenge_Et in ES umgewandelt:

Setzt man die Gleichungen 3.4 und 3.5 in Gleichung 3.2 ein, so ergibt sich:

Die Komplexkonstante_KS für ein Enzym ist die Michaelis-Menten-Konstante_KM, da eine Konstante sowohl für diesen speziellen als auch für den allgemeinen Fall gleich bleibt. Um einen Weg zur Messung_{von KM} zu finden, müssen wir uns Gleichung 3.2 im allgemeinen Fall, d. h. für jeden Wert von [S], ansehen und sie mit dem gemessenen Strom in Verbindung bringen. Wie wir aus dem vorigen Kapitel wissen, hängt der Strom von der Reaktionsgeschwindigkeit_vR ab. Aus Gleichung 3.3 kennen wir bereits den Zusammenhang zwischen_vR und [S] und können daraus den Zusammenhang mit dem interessanteren_vmax ableiten, da_vmax erreicht wird, wenn das gesamte Enzym in ES umgewandelt ist.

Gleichung 3.7 verdeutlicht diese Schlussfolgerung. Die Anwendung von Gleichung 3.6 in Verbindung mit Gleichung 3.2 führt zu einem neuen Ausdruck für [ES] (Gleichung 3.8).

Unser Ziel ist ein Ausdruck, der alle Parameter enthält, die uns interessieren und die wir durch eine Messung bestimmen können. Gleichung 3.8 enthält_vR nicht, und wir benötigen diesen Wert, um eine Verbindung zu unserer Messung herzustellen, da er mit dem Strom korreliert. Das fehlende_vR lässt sich einführen, indem man [ES] in Gleichung 3.3 durch Gleichung 3.8 ersetzt.

Bei einer amperometrischen Messung können wir die Substratkonzentration [S] steuern und messen die_vR als Strom I. Die unbekannten Werte in Gleichung 3.9 sind die beiden Werte, die wir bestimmen möchten:_vmax und_KM. Wissenschaftler ziehen es vor, eine Gleichung in eine lineare Form zu bringen, da dies oft eine gute Bestimmung fehlender Parameter mittels einer linearen Anpassung ermöglicht. Wenn Gleichung 3.9 umgekehrt wird, lässt sich eine lineare Form erzielen:

Gleichung 3.10 ist als Lineweaver-Burk-Gleichung bekannt. Gemäß der Lineweaver-Burk-Gleichung sollte ein Diagramm von_1/vR gegen 1/[S] eine Gerade mit dem Schnittpunkt_1/vmax und der Steigung_KM/vmax ergeben. Ein solches Diagramm wird als Lineweaver-Burk-Diagramm bezeichnet, doch in einem amperometrischen Experiment wird 1/I gegen 1/[S] aufgetragen (siehe Abbildung 3.2).

Die Kenntnis der Michaelis-Menten-Konstante_KM hat einen weiteren Vorteil. In Abbildung 3.1 ist zu erkennen, dass die Sättigungskurve zu Beginn nahezu linear verläuft. Quantitative Messungen müssen in der Regel in diesem linearen Abschnitt der Kurve erfolgen. Die Kurve kann bis zu einer Konzentration von_KM als linear betrachtet werden. Ist die Michaelis-Menten-Konstante bekannt, ist auch der lineare Messbereich des Biosensors bekannt. Typische Werte für_KM liegen zwischen ^10⁻² und ^10⁻⁶ mol/l.